1、壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究 暨南大学本科生毕业论文毕业论文壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究摘 要硒代胱氨酸(SeC)是一种天然的含硒氨基酸，研究证明，SeC作为一种新型高效的抗肿瘤药物在肿瘤化学预防与治疗中发挥着重要的作用。然而，SeC进入肿瘤细胞与其作用需要较长一段时间，细胞渗透性较差。高分子载药纳米粒子是近年来发展起来的新剂型，药物经其包裹后，不仅可以提高药物稳定性，而且还可以大大提高药物的生物利用率。壳聚糖(CS)是一种优良的天然药物载体，具有良好的生物相容性，生物可降解性和无毒性,被广泛地用作医药载体。本文以壳聚糖为载体，戊二醛
2、为交联剂，液体石蜡为乳化体系，制备出粒径小，分散性好，载药率及包封率较高的SeC壳聚糖纳米粒子。最后通过细胞毒性实验，表明以壳聚糖纳米粒子为药物载体能够增强SeC对MCF-7乳腺癌细胞的抑制作用，并增强其体外抗肿瘤活性。关键词：壳聚糖纳米粒子；乳化交联法；硒代胱氨酸；体外抗肿瘤活性Preparation and in vitro anticancer activity of Selenocystine-loaded chitosan nanoparticlesAbstractSelenocystine (SeC), a naturally occurring selenoamino acid,
3、 has been shown to be a novel compound with broad-spectrum anticancer activity. However, it takes a long time for SeC to interact with cancer cells due to its poor solubility and stability. Polymer, a new drug carrier, is widely used in pharmaceutical field. The encapsulation of drug helps to improv
4、e drug stability as well as anticancer activity. Chitosan is a popular drug carrier due to its biocompatible, biodegradable and nontoxic properties. In this paper, Chitosan loaded SeC nanoparticles were prepared in emulsion by using glutaraldehyde as crossing agent, span80 as emulsifier and paraffin
5、 as oil phase. Lastly, its proved that chitosan nanoparticles loaded SeC had greater toxicity and antitumor activity to MCF-7.Key words: Chitosan nanoparticles; cross-linking emulsification; Selenocystine; in vitro anticancer activity 目 录摘 要IAbstractII第一章 绪论31.1 硒抗癌药物的研究进展31.2 硒代胱氨酸的研究现状31.2.1 硒代胱氨酸
6、的性质31.2.2 硒代胱氨酸的抗癌作用31.3 纳米药物载体在肿瘤治疗中的应用31.3.1 纳米技术的研究进展31.3.2 纳米药物载体的研究进展31.4 壳聚糖纳米粒子在纳米药物载体领域的制备和应用31.4.1 壳聚糖的结构与性质31.4.2 壳聚糖纳米粒子的制备31.4.4 壳聚糖纳米粒子的应用31.5 课题的研究意义与创新点31.5.1 课题的研究意义31.5.2 创新点3第二章 空白壳聚糖纳米粒子的制备32.1 实验部分32.1.1 材料与试剂32.1.2 实验仪器32.1.3 实验方法32.2 实验结果与讨论32.4.1 油相体系对壳聚糖纳米粒子的影响32.4.2 油水比对壳聚糖纳
7、米粒子的影响32.4.3 表面活性剂用量对壳聚糖纳米粒子的影响32.4.4 壳聚糖浓度对壳聚糖纳米粒子的影响32.4.5 交联剂用量对壳聚糖纳米粒子的影响32.5 本章小结3第三章 壳聚糖纳米粒子负载硒代胱氨酸的制备33.1 实验部分33.1.1 实验材料33.1.2 实验仪器33.1.3 实验方法33.2 实验结果与讨论33.2.1 粒径分布及其稳定性的分析33.2.2 TEM分析33.2.2 包封率与载药率的计算33.3 本章小结3第四章 细胞毒性的研究34.1 实验部分34.1.1 实验试剂34.1.2 实验仪器34.1.3 实验原理34.1.4 实验步骤34.2 结果与讨论34.2.1
8、 粒径分布34.2.2 TEM分析与EDX分析34.2.3 载药率与包封率34.2.4 细胞存活率34.3 本章小结3第五章 总结与展望35.1 总结35.2 展望3致 谢3参考文献3IV壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究第一章 绪论1.1 硒化学的研究进展硒是机体生命活动不可缺少的一种微量元素，被称为“生命奇效元素”1。1817年，硒由瑞典学者Berzelius发现，并命名为Selenium。但由于毒性，硒曾被认为是一种对高级生物有害的元素。1957年美国营养学家Schwarz和Foltz首次用硒治疗动物肝坏死取得成功后，硒逐渐明确为动物体内必需的微量元素2 。197
9、3年，Rotruck等人发现硒是谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px的活性成分后3，已经陆续有25种含硒蛋白被发现。1975年Awasthi等人首次明确指出，硒是人体必需的微量元素4。此后，硒与硒化合物的生理作用受到普遍关注。1988年，我国已经把硒列为膳食营养素之一。近年来研究发现，硒与人类40种疾病有关，如大骨节病、克山病、白内障、癌症等。硒可以保护心脏、肝脏等免受损伤，对癌症、心血管疾病、艾滋病等起到治疗和控制作用5-7。微量元素硒具有防癌，抗癌，抗氧化，拮抗重金属，抗逆境等多种生物学活性8 。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在，GSH
10、-Px能减轻或阻断自由基所致的脂质过氧化连锁反应，保护蛋白质、清除自由基和DNA及生物膜的完整性，修复损伤分子部位；同时能提高机体免疫能力，抵抗疾病9。近年来，硒与硒化合物的抗肿瘤活性受到普遍关注，人们一直致力于设计和改造含硒化合物，以寻找抗肿瘤活性强，抗肿瘤谱广，毒副作用低，适用于临床的含硒抗肿瘤药物1。根据硒在自然界的存在形态，硒化合物可分为无机硒和有机硒化合物10。无机硒主要包括硒，硒酸盐(亚硒酸钠,亚硒酸锌等)，氧化硒，硫化硒，氯化硒以及硒化物（硒化氢，硒化钠，硒化钾等）等。有机硒主要包括硒多糖，含硒蛋白质，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有机硒化合物。硒在生物体内主要以有
11、机硒化合物的形式存在，一类是含硒氨基酸，另一类是含硒蛋白质。无机硒具有较好的抗癌活性，但无机硒化合物脂溶性差，不易进入细胞，且具有蓄积毒性和致突变作用，限制了它在临床上的应用。而相比之下，有机硒化合物吸收率高，生物活性强，毒性低和环境污染小，不仅能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上也比无机硒显著，抗癌作用更强11。其中含硒氨基酸-硒代半胱氨酸（selenocysteine）是生物合成和掺入到蛋白质分子中的第21种氨基酸12。从此有机硒化合物的研究引起了广泛关注，Shahd等人在2005年报道了有机硒化合物Methylseleninic acid (MSA)和它莫西芬一起可以治疗子宫内膜
12、癌和乳腺癌13。1.2 硒代胱氨酸的研究现状1.2.1 硒代胱氨酸的性质硒代氨基酸在有机硒化合物中，有特殊的重要性。在哺乳动物组中，硒代氨基酸是硒的主要存在形式，包括硒代胱氨酸(SeCys) 和硒代蛋氨酸(SeMet)。硒代胱氨酸是胱氨酸分子中S被Se所取代后的含硒氨基酸14。结构式如图1.1。图1.1 硒代胱氨酸的结构式1.2.2 硒代胱氨酸的抗癌作用SeC，是一种天然存在的含硒氨基酸，在化学预防与治疗方面具有巨大的潜力。Chen等15通过实验比较几种含硒化合物对八种人类癌症细胞的抗癌活性，实验证明，SeC与亚硒酸盐对A375，MCF-7，HepG2，SW620等癌细胞的细胞毒性比硒代蛋氨酸
13、，硒甲基硒氨酸，硒酸盐等强。且SeC对人类正常纤维原细胞Hs68的细胞毒性很小，IC50400 ，毒性远小于亚硒酸盐。因此，SeC具有更广谱高效的抗肿瘤活性，且对正常细胞的毒性较小。因此，SeC是一种新型高效的抗肿瘤药物。虽然SeC作为抗肿瘤药物具有较强的抗肿瘤活性，但是从Chen等16实验结果表明，SeC的水溶性与稳定性较差，进入MCF-7细胞发挥作用的时间比较长，36 h之后才观察到明显的细胞凋亡的现象，且72 h后的IC50=16.25.2 ，说明SeC不易进入肿瘤细胞，对细胞的渗透性不强。因此，希望借助纳米药物载体来提高细胞吸收，减少它进入肿瘤细胞的时间。1.3 纳米药物载体在肿瘤治疗
14、中的应用1.3.1 纳米技术的研究进展早在1959年，著名物理诺贝尔奖获得者Feynman就预言了纳米科技的出现及前景。1990年7月，在美国巴尔的摩召开了第一界国际纳米科技会议，标志着纳米科技的正式诞生。纳米，是尺寸度量单位，1纳米=10-9 米，相当于4个原子并列的直径。所谓纳米技术则是指0.1-100 nm内的物质或结构的构造技术，即纳米级材料的设计，制造，测量和控制技术17。纳米材料具有小尺寸效应、量子尺寸效应，表面效应和宏观量子隧道效应四大效应。当物体达到纳米级后，纳米粒子在热学、光学、磁学力学及电化学方面表现出独特的优势18。进入21世纪，纳米技术迅速发展，作为一个多学科交叉领域，
15、涉及面广应用十分广泛。纳米技术与材料已经在航天，汽车，消费日用品，生物医学领域获得应用，并取得一些列举世瞩目的成果19。随着纳米技术向医学界不断渗透，纳米技术在生物医药方面的应用，特别在肿瘤的诊断和治疗方面，受到了广泛的关注17。纳米技术在肿瘤治疗中的应用主要表现在一下几个方面：控释载药微粒，靶向载药微粒，磁导航靶向载药微粒，基因载体20。其中，纳米药物载体在医学领域中控释缓释的应用极为广泛，提高药物的利用率疗效和减少药物的副作用已成为医药研究领域的一项重要课题。1.3.2 纳米药物载体的研究进展理想的纳米粒载体应是无毒和可生物 的。一种理想的纳米药物载体应具备以下特征21 ：具有较高的载药量具有较高的包封率 制备和纯化方法简便，容易放大到工业化生产 载体材料可生物降解，毒性较低或没有毒性 具有适当的粒径与粒型 具有较长的体内循环时间纳米药物载体的种类有以下几种（如图1.2所示）：纳米聚合物药物载体 ，包括：聚合物纳米粒（纳米囊和纳米球）纳米树突状
