1、第四章第四章 植物基因工程植物基因工程 植物基因工程是近植物基因工程是近2020年来随着年来随着DNADNA重组技术、重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。来的现代生物技术。 通过植物基因工程获得转基因植物，在农业通过植物基因工程获得转基因植物，在农业生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的意义。目前，已获得很多有重大经济价值的转基意义。目前，已获得很多有重大经济价值的转基因植物。因植物。基因工程的基本步骤目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子
2、外源基因的表达和产物的分离重组子的检测本节主要内容根癌农杆菌介导法基因枪介导法其它转化方法第一节第一节 植物遗传转化方法植物遗传转化方法常用的植物转基因方法：常用的植物转基因方法：l到目前为止到目前为止, , 已确立了已确立了1111种植物转基因方法。根据其种植物转基因方法。根据其转化原理，可分为三大类，即转化原理，可分为三大类，即利用载体的转化系统利用载体的转化系统，不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外源基因不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外源基因导入受体细胞的导入受体细胞的直接转化系统直接转化系统以及利用植物生殖细胞以及利用植物生殖细胞等种质媒介的等种质媒介的种质转化系统种质转化
3、系统。l现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和受现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和受体细胞等归纳如图体细胞等归纳如图4-14-1。一、根癌农杆菌介导法l根癌农杆菌介导法的分子机制l农杆菌介导法需要具备的条件l农杆菌介导法的基本流程1 1、植物冠瘿瘤、植物冠瘿瘤植物的一种癌症植物的一种癌症（1）冠瘿瘤的起因：）冠瘿瘤的起因： 由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。（2）冠瘿瘤的侵染过程：）冠瘿瘤的侵染过程： 细菌通过伤口进入植物，在基因水平细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植中的编码基因在植物细胞中表达，
4、刺激植物细胞不受控制的物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。分裂，形成瘤。（一）根癌农杆菌介导法的分子机制（一）根癌农杆菌介导法的分子机制2 2、TiTi质粒质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的价闭合环状的DNADNA分子。分子。为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；参与寄主细胞合成激素的能力；参与寄主细胞合成激素的能力；诱发植物产生冠瘿瘤；诱发植物产生冠瘿瘤；赋予寄主分解冠瘿碱的能力；赋予寄主分解冠瘿碱的能力；决定寄主范围。决定寄主范围。 （1 1）TiTi质粒的功能质粒的功能（2 2）TiTi质
5、粒的功能区域质粒的功能区域 T-DNA区区 Vir 区区 Con 区区 Ori 区区200 kb T-DNA区（区（transferred-DNA regions）：）： 核心区核心区左边界左边界右边界右边界 T-DNA T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从TiTi质粒上质粒上切割下来转移到植物细胞的一段切割下来转移到植物细胞的一段DNADNA，故称之为转，故称之为转移移DNADNA。 该该DNADNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。片段上的基因与肿瘤的形成有关。lVirVir区是一段长度为区是一段长度为35KB35KB操纵子；操纵子；l包含六个基因：包含六个基因：Vi
6、rAVirA、VirBVirB、VirCVirC、VirDVirD、VirEVirE、VirGVirG。l该区段上的基因能激活该区段上的基因能激活T-DNAT-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。故称之为毒性区。lT-DNAT-DNA区与区与VirVir区在质粒区在质粒DNADNA上彼此相邻，上彼此相邻， 合起来约占合起来约占TiTi质粒质粒DNADNA的三分之一的三分之一。 Vir区操纵子基因的结构与功能区操纵子基因的结构与功能LBRBT-DNAVir Con区（区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转
7、移的有关基因（该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），），调控调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，基因，诱导诱导Ti质粒转移，因此称之为质粒转移，因此称之为接合转移编码区接合转移编码区。 Ori区（区（origin of replication） 该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为质粒的自我复制，故称之为复制复制起始区起始区。定向转移到寄主植物细胞内定向转移到寄主植物细胞内T-DNAT-DNA链整合植物基因组链整合植物基因组受伤植物产生酚类物质，诱导受伤植物产生酚类物质，诱导VirVir基因的表达基因的表达
8、编码编码 核酸内切酶核酸内切酶依次在依次在RBRB、LBLB序列中产生缺口序列中产生缺口单链单链T-DNAT-DNA被释放被释放3、T-DNA转移的机制转移的机制植物细胞酶体系合成双链合成双链T-DNAT-DNA链分子链分子VirE2蛋白的核定位作用4、植物遗传转化的载体系统、植物遗传转化的载体系统一元载体（顺势载体）一元载体（顺势载体）双元载体（反式载体）双元载体（反式载体） Ti Ti质粒分子量过大，一般在质粒分子量过大，一般在160160240kb240kb； 分布各种限制酶的多个切点；分布各种限制酶的多个切点； T-DNA T-DNA区内含有许多编码基因，干扰宿主植物中内源激区内含有许
9、多编码基因，干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；的再生； Ti Ti质粒不能在大肠杆菌中复制质粒不能在大肠杆菌中复制, , 即使得到重即使得到重组质粒，粒，也只能在也只能在农杆菌中杆菌中进行行扩增；增； Ti Ti质粒上还存在一些对于质粒上还存在一些对于T-DNAT-DNA转移不起任何作用的基转移不起任何作用的基因。因。 野生型野生型TiTi质粒不能直接作为植物基因工程载体：质粒不能直接作为植物基因工程载体：5、农杆菌介导的转化质粒的构建、农杆菌介导的转化质粒的构建P G2 T NOSAmpAmpr r P
10、 G1 T目的基因目的基因报告基因，选择标记基因报告基因，选择标记基因目的基因目的基因报告基因，选择标记基因报告基因，选择标记基因LBRB启动子的选择启动子的选择35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues. （二）农杆菌介导法需要具备的条件（二）农杆菌介导法需要具备的条件l高效的植物基因转化受体系统高效的植物基因转化受体系统l受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。受体植物细胞对农杆菌要有
11、很高的亲和力。l具有有效的选择系统。具有有效的选择系统。l稳定的转化技术和基因表达。稳定的转化技术和基因表达。1、高效的植物基因转化的受体系统、高效的植物基因转化的受体系统成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。的建立。受体系统受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径：用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径（如发苗产生子叶、胚轴或其它非组织培养途径（如发苗产生子叶、胚轴等），能高效、稳定地再生无性系，并能接受外等），能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源源DNADNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。整合，对转化选择抗生素
12、敏感的再生系统。A. 植物基因转化受体系统的条件植物基因转化受体系统的条件（1 1）高效稳定的再生能力）高效稳定的再生能力（2 2）较高的遗传稳定性）较高的遗传稳定性（3 3）具有稳定的外植体来源）具有稳定的外植体来源（4 4）对选择性抗生素敏感）对选择性抗生素敏感（5 5）对农杆菌侵染有敏感性）对农杆菌侵染有敏感性（6 6）具有经济价值或理论研究意义。）具有经济价值或理论研究意义。B. 植物基因转化受体系统的类型植物基因转化受体系统的类型1.1.愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（含目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。优点：外植体来源
13、广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。缺点：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统2.直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：材料局限，转化率低。3.原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统；缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。4.胚状体再生系统是指具有胚胎性质的个体。优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强，
14、嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。5.生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。2、选择系统、选择系统l选择是为了将转化细胞与非转化细胞区分开，使选择是为了将转化细胞与非转化细胞区分开，使转化细胞具有生长优势。在构建载体时，往往在转化细胞具有生长优势。在构建载体时，往往在目的基因上连上一个选择标记基因。目的基因上连上一个选择标记基因。l主要是编码可使抗生素或除草剂
15、失活的蛋白酶基主要是编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。因。l最常用的有：新霉素磷酸转移酶基因最常用的有：新霉素磷酸转移酶基因( NPT( NPT) )、新霉、新霉素抗性基因（素抗性基因（neoneo）、庆大霉素抗性基因（）、庆大霉素抗性基因（gentgent）、潮）、潮霉素磷酸转移酶基因（霉素磷酸转移酶基因（hpthpt）, ,以及膦丝菌素乙酰转移以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（酶基因（barbar）等。）等。l新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5Tn5中分离的，中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G41
16、8G418。l对茄科植物（烟草、马铃薯、番茄）转化特别有对茄科植物（烟草、马铃薯、番茄）转化特别有效，对豆科和单子叶植物效果不佳。效，对豆科和单子叶植物效果不佳。A、新霉素磷酸转移酶基因（、新霉素磷酸转移酶基因（Npt-II）B、庆大霉素抗性基因（、庆大霉素抗性基因（gent）l该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。l该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟草和番茄。草和番茄。 潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉素有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。磷酸化而使其失活。C、潮霉素磷酸转移酶基因（、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）D、膦丝菌素乙酰转移酶基因（、膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）l该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂为膦丝菌素（应的选择试剂为
