1、生物制品分析概论,第二军医大学药学院,本章内容,背景概述鉴别试验杂质检查含量（效价）测定,第一节 背景概述,生物药物（Biopharmaceutics或Biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。广义的生物药物应包括从动物、植物和微生物等生物体中直接制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。,一、生物药物与生物制品,生物药物发展,第一代生物药物：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物质与混合成分的粗提物制剂 甲状腺粉及其片剂、鱼肝油与鱼肝油酸钠
2、注射液、胰酶及其肠溶片、肠溶胶囊等第二代生物药物：根据生物化学和免疫学原理，应用近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成分尿激酶、肝素钠、抑肽酶、胰岛素、人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子、人纤维蛋白原,生物药物发展,第三代生物药物：应用生物工程技术生产的天然生理活性物质，以及通过蛋白质工程原理设计制造的具有比天然物质更高活性的类似物，或与天然物质结构不同的全新的药理活性成分。重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人干扰素1b、重组人白细胞介素-2、重组人红细胞生成素（EPO）等,生化药物,生物合成药物,生物制品,生物药物分类,生物药物分类,生化药物:一般系指从动物、植物
3、及微生物提取的，也可用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰物等，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、脂质、核苷酸类等。生物合成药物:由微生物代谢所产生的药物和必须利用微生物及其酶转化反应共同完成的半合成药物，如山梨醇、木糖醇、甘露醇、枸橼酸、氨基酸、维生素、生物碱、甾体激素、抗生素和一些核苷酸、酶与辅酶类药物等。,生物药物分类,生物制品:以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断。,生长激素释放抑制激素的生产：10万只羊下丘脑1mg10L大肠杆菌工程菌株发酵液核酸疫苗制备技术
4、路线：目的抗原基因的选择与分离与载体DNA连接转入宿主扩增质粒重组质粒提取、纯化与后处理,二、生物制品的种类与特点,疫苗类药物细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗和类毒素抗毒素及抗血清类药物破伤风抗毒素等血液制品人血白蛋白、人免疫球蛋白、人纤维蛋白原生物技术制品 重组人表皮生长因子凝胶（酵母）、重组人p53腺病毒、基因工程乙肝疫苗、单克隆抗体等微生态活菌制品如双歧杆菌活菌胶囊、地衣芽孢杆菌活菌颗粒、酪酸梭菌活菌片等诊断制品体外诊断制品（HBsAg酶联免疫诊断试剂盒）、体内诊断试剂,二、生物制品的种类与特点,分子量不定值不同的相对分子质量产生不同活性生化法结构确证定期监测制品肽图需检查生物活性生物检
5、定法证实活性安全性检查宿主蛋白残留量，提取溶剂残留量效价测定酶活力测定,三、生物制品全程质量控制注射用重组链激酶产品的全程质量控制过程,对生物制品的质量控制重点,有效成分的同一性、结构确证；有效成分的均一性、纯度检验；有害物质及残余杂质（特殊杂质）等的控制；高效、灵敏的生物活性及比活性等实验方法。为了正确反映生物制品的性质与特性，生物制品质量控制的基本方法一般应包括鉴别试验、杂质检查、安全性检查和含量（生物学活性或效价）测定。,第二节 鉴别试验,依据生物制品的化学结构、理化性质和生物学特点，利用化学法、物理法及生物学方法进行某些特殊反应，或测定某些专属的理化常数如紫外吸收系数、等电点、电泳迁移
6、率、色谱保留时间和肽图等，来判断与确证产品的真伪。需要标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。生物制品的鉴别不是由一项试验就能完成，而是依据其特异的分子结构和(或)其他特性(包括理化性质和生物学活性等)设计一组试验来全面评价一种药物。,一、理化鉴别法,化学法：通常利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。蛋白质类生物制品蛋白质变性反应胰蛋白酶+对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐紫色胃蛋白酶+鞣酸、没食子酸或多数重金属盐的溶液沉淀紫外分光光度法：蛋白质类生物制品的紫外吸收光谱是由于芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸光吸收的结果。对于一个蛋白或多肽分子来说
7、，它的最大吸收波长是固定的，不同批次产品的紫外光谱图也应该是一致的。,一、理化鉴别法,高效液相色谱法：基于生物制品供试品溶液和对照品溶液色谱图中主峰保留时间和肽图的一致性，可用于目的产品的鉴别。,重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经胰蛋白酶裂解后的RP-HPLC（左）和CZE（右）肽图典型谱图,一、理化鉴别法,示例：胰岛素的鉴别（1）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。（2）取本品适量，用0.1三氟醋酸溶液制成每lml中含10mg的溶液，取20l，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.3)20l、0.1V8酶溶液20
8、l与水140l，混匀，置37水浴2小时后，加磷酸3l，作为供试品溶液；另取胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。,一、理化鉴别法,照含量测定项下的色谱条件，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(90:10)为流动相A，乙腈-水(50:50)为流动相B，按右表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各25l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。,二、生化鉴别法,酶法：利用酶对底物特异性的催化活力，可以作为酶类生物制品简便、快速、灵敏的鉴别方法。尿激酶的鉴别：尿激酶 用巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)溶解 成1ml(含20单位)+牛纤维
9、蛋白原溶液0.3ml 再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液0.2ml，牛凝血酶溶液0.2ml，迅速摇匀，立即置370.5恒温水浴中保温，记时，反应系统应在30s45s内凝结，且凝块在15min内重新溶解。,以0.9氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2h内不溶。,二、生化鉴别法,电泳法：应用电泳技术如等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等，获得目的产品的一致性、同一性的电泳图谱和数据，可用于蛋白质类生物制品的鉴别。等电聚焦电泳用于检测蛋白质类生物制品的等电点，例如中国药典2010年版三部收载的重组人干扰素1b、2a、2b和等电点，依法测定，主区带应分别为4.06.5、5.56.8、4.
10、06.7和8.19.1。,二、生化鉴别法,示例：重组人生长激素的鉴别 取本品，加水溶解制成每1ml中含1mg的溶液，取此溶液90l，加两性电解质10l和甲基红试液2l，混匀，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品，同法制备，作为对照品溶液。取对照品溶液和供试品溶液各10l，加至上样孔，照等电聚焦电泳法（附录 F第六法）试验，供试品溶液主带位置应与对照品溶液主带位置一致。,三、生物鉴别法,血清学法体外抗原抗体试验。抗原抗体反应具有高度的特异性，只要一方已知，即可检测出另一方。如凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应，以上四种类型反应即所谓的经典血清学反应。,三、生物鉴别法,示例：人血白蛋白
11、的鉴别 采用免疫双扩散技术，依法测定（附录 C），供试品仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊的血清不产生沉淀线。选择免疫电泳技术，依法测定（附录 D），供试品与正常人血清比较，主要沉淀线应为白蛋白。,三、生物鉴别法,生物学法利用生物体对生物制品特定的生物活性的反应为基础进行供试品的鉴别即为生物学法。,三、生物鉴别法,示例：注射用重组人促红素（CHO细胞）人促红素具有刺激网织红细胞生成的生物作用。给小鼠皮下注射供试品后，其血液中网织红细胞的数量随着人促红素注射量的增加而升高。因此，中国药典2010年版三部收载的注射用重组人促红素（CHO细胞），其原液的检定依据人促红素独特的生物学活
12、性，即采用网织红细胞法。,第三节 杂质检查,生物制品的杂质检查可用来判定产品的优劣。一般地，只要在不影响临床疗效及人体健康的原则下，药品质量标准可以允许生产过程和贮藏过程中引入的微量杂质的存在。生物制品来自生物体，生物活性特异性强，制造与纯化工艺复杂，分子结构常常不确定，有时产品成分并非单一，极微量杂质可能产生显著的效应，因此，生物制品的杂质检查就显得尤为重要，涉及的项目也各有特点，主要包括一般杂质检查、特殊杂质检查和安全性检查。,一、特殊杂质检查,特殊杂质是指药品在生产和贮藏过程中可能引入的特有杂质。特殊杂质检查意义是特殊杂质可能存在的毒性会引起安全性问题；可能影响产品的生物学活性和药理作用
13、，或使产品变质；也反映产品生产工艺的稳定性。生物污染物微生物、外源性DNA等产品相关杂质二聚体，多聚体，突变物等工艺添加剂残余抗生素，甲醛，吐温80，曲拉通X-114等,（一）宿主细胞（菌）蛋白残留量,中国药典2010年版均采用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。,酶标板固相,兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体,加入供试品菌体蛋白与抗体结合,洗涤,加入辣根过氧化酶标记的抗体,加入专一性底物，反应后测定492nm吸光度值,菌体蛋白含量,示例：ELISA法检测大肠杆菌表达系统生产的重组
14、制品中残留菌体蛋白含量ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。1、在测定时，受检标本(测定其中的残留菌体蛋白抗原)与固相载体表面的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体起反应；2、通过洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开；3、加入辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体，也形成抗原抗体复合物而结合在固相载体上。,示例：ELISA法检测大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体蛋白含量4、因此，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例；5、加入酶反应的底
15、物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关；6、故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使宿主细胞（菌）残留蛋白测定方法达到很高的敏感度，以保证生物制品的安全有效。,具体操作：取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释成每1ml中含l0g的溶液，以100l/孔加至96孔酶标板内，4放置过夜(16h18h)。用洗涤液洗板3次；用洗涤液制备1牛血清白蛋白溶液，以200l孔加至板内，37放置2h；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以1001孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入两孔空白对照(稀释液)，
16、37放置2h；用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000倍，以1001孔加至板内，37放置1h，用洗涤液洗板10次，以1001孔加入底物液，37避光放置40min，以50l孔加入终止液终止反应。用酶标仪在492nm波长处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白含量。,（二）外源性DNA残留量,随着生物技术的发展以及人们对细菌、病毒和细胞的长期研究与不断认识，制造生物制品的宿主细胞（菌）残留DNA（外源性DNA）的安全性问题逐步清晰，大样本、长时间的临床试验进一步证实生物制品中外源DNA不应该视为一个潜在的危险因素，而是作为生物制品中一个不纯的、应该去掉的杂质成份来对待，为此有关外源性DNA的限量要求也随之放宽。外源性DNA的测定方法目前主要有三种，即分子杂交（Hybridization）技术、基于DNA结合蛋白(Threshold)分析系统和实时定量PCR（Q-PCR）方法。,生物制品中外源性DNA残留检测方法的比较,（三）产品相关杂
