1、实验十 片段从琼脂糖凝胶中的分离,DNA fragment recovery from the agrose gel,一实验目的及背景,在生物技术实验中，反应获得的目的片段，酶切后所得特定的序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它分开，这就需要有一套方法将目的从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等.,从凝胶中分离回收的方法,现在常用的技术有：电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法滤膜插片法等其中电洗脱法，经济节省，操作方便，对的回收效果好。,低熔点琼脂糖凝胶法,65oC琼脂糖凝胶熔点低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体,滤膜插片法,
2、High efficientDNA high quality for microinjection5kb fragment100ng DNA fragment10mmol/L EDTA(pH8.0)5 minutes0.5 mol/L NaOH 5 minutes低盐缓冲液50mM/LTris.Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)高盐缓冲液50mM/LTris.Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0),电洗脱法基本原理,将电泳分离后含目的片段的琼脂糖切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的会从凝胶中电泳出进入透析袋中，由于分子量
3、大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。取出透析袋中含的溶液，进一步用酚、氯仿抽提纯化。,二实验试剂及仪器,NaHCO3 2%EDTA-Na2 0.01MTBE电泳液10.8g Tris碱0.93g EDTA5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml琼脂糖 透析袋 酚 氯仿 乙醇,三、实验方法,一、透析袋的处理：切取适当长度适析袋。在NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸分钟。弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。,二、电洗脱,在长波紫外灯下（nm）将含目标片段的凝胶条带切下装入透析袋中。向透析袋内加入ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行
4、），加入适量缓冲液将透析袋浸没（约mm）。接通电源，伏电洗，在紫外灯下观察待全部移出凝胶。改变电场方向继续通电分钟。从透析袋中吸出缓冲液于ml Eppendorf管中。,加入倍体积正丁醇，混匀抽提去。在台式离心机上最高速分钟。吸去上层，正丁醇溶液。重复，二次。自下层言的溶液中加入等体积酚氯仿（个）抽提次。上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc 倍体积预冷无水乙醇，于过夜。,12000g，4下离心分钟，得沉淀。弃上清，加入乙醇洗涤次后弃干乙醇。加入l 溶解。取l 溶液加入2l Loading buffer于琼脂糖上，伏电泳，小时。在紫外透射仪上观察结果。测定溶液OD2
5、60,OD280值。,结果与分析,计算回收效率，判断纯度。记录电泳结果问题与讨论：电洗脱过程后，为什么要反向电泳分钟？电洗脱后的如何去除？,玻璃奶法快速纯化回收DNA片段,本方法有多种用途，主要包括：从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段；从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段；从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）；DNA浓缩、去盐及去除杂质。本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀作用的白色颗粒，能专一性结合0.2kb到50kb大小的DNA（双链或单链，线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡聚核苷酸、
6、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。,使用本法回收DNA片段有以下优点：,高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等；简便：所需主要仪器是一架台式离心机；快速：整个回收过程只需半个小时；高效：回收得率达到70%以上；多用途：可以同时作胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等；安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。,二、试剂盒组成,1碘化钠溶液：50ml2DNA洗涤液（20倍浓缩液）：10ml3“基因纯”试剂：1ml4超纯水：1ml使用前，将DNA洗涤浓缩液（10ml）倒入一玻璃瓶中，加140ml无水乙醇及5
7、0ml蒸馏水（由使用者自配），混匀后置于-20冰箱中，其余溶液置于4冰箱。,三、操作步骤,从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段a.常规DNA电泳。按常规方法用溴化乙锭（EB）染色DNA，而后将欲分离的DNA带从胶上切割下来，置于一1.5ml离心管中。b.称出凝胶带的重量，加入三倍量（V/W）的碘化钠溶液。（如0.1g凝胶中加入0.3ml碘化钠溶液）。c.置于55水浴5-10分钟，直至凝胶完全溶化。d.加入20ul充分混匀的“基因纯”试剂（建议使用前用漩涡振荡器振荡3分钟），室温放置5分钟（期间不时将管子颠倒几次以混匀）。,e.离心10秒（10,000rpm），倒去上清液。f.加0.8ml刚从冰箱中
8、取出的DNA洗涤液，充分摇匀，离心10秒，去上清。g.重复步骤f两次（共洗涤三次）。h.用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。i.加入20ul超纯水，混匀后置于55水浴5分钟。j.离心3分钟，将上清液小心吸至另一个离心管，即为纯化的DNA。可直接用于酶切、亚克隆、PCR、标记、探针制备、序列测定、细胞转染等。,注意事项：,溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。DNA洗涤液应保持在低温，否则可能使DNA从“基因纯”试剂上脱落而导致回收率降低。步骤h是另一关键，管壁和管底残留的洗涤液若不完全除去，可能导致“基因纯”试剂上结合的DNA
9、无法由蒸馏水洗脱。,PCR反应物中纯化目的DNA片段,PCR反应完毕后，加蒸馏水至100ul（最后体积）。加入300ul碘化钠溶液，混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。,从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的DNA片段,探针制备反应完毕后，加蒸馏水至100ul（最后体积）。加入300ul碘化钠溶液，混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。,DNA浓缩，去盐及去除杂质,加入3倍量的碘化钠溶液于样品DNA溶液中（若DNA为固态，则先将之溶于适量水或TE中，再加3倍体积的碘化钠溶液）。加20ul或更多的“基因纯”试剂（每ul该试剂可吸附0.3ugDNA，操作者可根据这一指标自行决定“基因纯”试剂的用量，但不应少于10ul）。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。,
