1、临床基因扩增检验操作规范临床基因扩增检验操作规范浙浙江江省省基基因因诊诊断断中中心心浙江大学医学院附属儿童医院浙江大学医学院附属儿童医院尚世强尚世强一、临床基因扩增检验实验室的一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求二、各阶段操作要求三、三、PCR污染与对策污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析四、因操作欠规范导致的问题分析一、临床基因扩增检验实验室的一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能规范化设置及其各室的功能规范化设置：规范化设置：要求参照要求参照临床基因扩增检验实临床基因扩增检验实验室管理暂行办法验室管理暂行办法（卫医
2、发（卫医发200210号文）附件号文）附件临床基因扩增检验实验临床基因扩增检验实验室基本设置标准室基本设置标准。1 1. .四个隔开的工作区域中每一区域都须有四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用专用的仪器设备。的仪器设备。2 2.明确的明确的标记标记，如加样器或试剂等。，如加样器或试剂等。3. 3.单一方向单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、顺序，从试剂贮存和准备区、标本标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区。称扩增区）至产物分析区。4. 4.使用使用不同颜色不同颜色或有明显区别标志的工作服。或有明显区别标志的工作服。5.5.实验
3、室的实验室的清洁清洁应按试剂贮存和准备区至扩增应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。产物分析区的方向进行。6. 6.各自各自的清洁用具。的清洁用具。各室功能：各室功能：（一）试剂贮存和准备区（一）试剂贮存和准备区功能：功能：贮存试剂的制备、试剂的分装和主贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备反应混合液的制备。 含含含含反反反反应应应应混混混混合合合合液液液液的的的的离离离离心心心心管管管管或或或或试试试试管管管管在在在在冰冰冰冰冻冻冻冻前前前前都都都都应快速离心数秒。应快速离心数秒。应快速离心数秒。应快速离心数秒。戴手套。戴手套。戴手套。戴手套。工作结束后必须立即对工作区进行
4、工作结束后必须立即对工作区进行工作结束后必须立即对工作区进行工作结束后必须立即对工作区进行清洁清洁清洁清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（实验台表面，使用可移动紫外灯（实验台表面，使用可移动紫外灯（实验台表面，使用可移动紫外灯（254254nmnm波长）波长）波长）波长）照射，一般照射过夜。照射，一般照射过夜。照射，一般照射过夜。照射，一般照射过夜。实验室及其设备的使用必须有实验室及其设备的使用必须有实验室及其设备的使用必须有实验室及其设备的使用必须有日常记录日常记录日常记录日常记录。 （二）标本制备区（二）标本制备区功能：功能：临床标本的保存，核酸（临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取
5、、贮存及其加入至扩增反应提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定管和测定RNA时时cDNA的合成。的合成。要要要要正确正确正确正确使用加样器。使用加样器。使用加样器。使用加样器。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须须须须盖好盖好盖好盖好含反应混合液的反应管。含反应混合液的反应管。含反应混合液的反应管。
6、含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有对具有潜在传染危险性的材料，必须有对具有潜在传染危险性的材料，必须有对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确明确明确明确的样的样的样的样本处理和灭活程序。本处理和灭活程序。本处理和灭活程序。本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用于用于用于用于RNARNA扩增检测的样本制备好以后，应扩增检测的样本制备好以后，应扩增检测的样本制备好以后，应扩增检测的样本制备好以后，应立即立即立即立即进进进进行行行
7、行cDNAcDNA合成。合成。合成。合成。 （三）扩增区（三）扩增区功能：功能：DNA或或cDNA扩增扩增。已已制制备备的的DNA模模板板和和合合成成的的cDNA的的加加入入和和主主反反应应混混合合液液制制备备成成反反应应混混合合液等也可在本区内进行。液等也可在本区内进行。在在巢巢式式PCR测测定定中中，第第二二次次加加样样必必须在本区内进行。须在本区内进行。可可降降低低本本区区的的气气压压以以避避免免气气溶溶胶胶从从本区漏出。本区漏出。如有加样则应在超净台内进行。如有加样则应在超净台内进行。打开反应管前快速离心数秒。打开反应管前快速离心数秒。（四）扩增产物分析区（四）扩增产物分析区功能：功能
8、：扩增片段的测定。扩增片段的测定。膜膜上上微微孔孔板板上上探探针针杂杂交交方方法法、Southern转转移移、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳、聚聚丙丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。本本区区是是最最主主要要的的扩扩增增产产物物污污染染来来源源。溴溴化化乙乙锭锭、丙丙烯烯酰酰胺胺、甲甲醛醛或或同同位位素素等等有有毒毒或或致致癌癌物物质质，注注意意实实验验人人员员的的安安全全防护防护。负压条件。负压条件。二、各阶段操作要求二、各阶段操作要求测测定定分分析析前前的的标标本本采采集集处处理理、测测定定中中的的核核酸酸提提取取、扩扩增增和和产产物物分分析析以以及测定后的结果
9、报告等。及测定后的结果报告等。（一）标本的采集（一）标本的采集 临临临临床床床床标标标标本本本本包包包包括括括括EDTAEDTA或或或或枸枸枸枸橼橼橼橼酸酸酸酸钠钠钠钠抗抗抗抗凝凝凝凝全全全全血血血血或或或或骨骨骨骨髓髓髓髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。 EDTAEDTA和和和和枸枸枸枸橼橼橼橼酸酸酸酸盐盐盐盐是是是是首首首首选选选选的的的的抗抗抗抗凝凝凝凝剂剂剂剂。不不不不能能能能使使使使用用用用肝肝肝肝素素素素抗凝，因抗凝，因抗凝，因抗凝，因肝素是肝素是肝素是肝素是T
10、aqTaq酶的强抑制剂酶的强抑制剂酶的强抑制剂酶的强抑制剂。 玻玻玻玻璃璃璃璃器器器器皿皿皿皿在在在在使使使使用用用用前前前前应应应应高高高高压压压压处处处处理理理理，250250烘烘烘烘烤烤烤烤4 4小小小小时时时时以以以以上可使上可使上可使上可使RNARNA酶永久性失活。酶永久性失活。酶永久性失活。酶永久性失活。 临临临临床床床床用用用用于于于于RNARNA（如如如如HCVHCVRNARNA）扩扩扩扩增增增增检检检检测测测测的的的的血血血血标标标标本本本本应尽快（应尽快（应尽快（应尽快（3 3小时以内小时以内小时以内小时以内）分离血浆，以避免）分离血浆，以避免）分离血浆，以避免）分离血浆，
11、以避免RNARNA的降解。的降解。的降解。的降解。（二）标本的稳定化处理（二）标本的稳定化处理DNA：不需特殊稳定化处理。不需特殊稳定化处理。RNA：异硫氰酸胍盐（异硫氰酸胍盐（GITC）可使可使DNA酶和酶和RNA酶失活。酶失活。（三）标本的运送（三）标本的运送可在常温下通过邮寄运送，如用于可在常温下通过邮寄运送，如用于DNA扩增检测的扩增检测的EDTA抗凝全血及用于抗凝全血及用于RNA扩增检测的扩增检测的GITC稳定化处理的标本。稳定化处理的标本。未经稳定化处理，则必须速冻后，放未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。在干冰中运送。（四）标本的贮存（四）标本的贮存1.血清血清/血浆等
12、血浆等-702.用于用于DNA测定的已测定的已纯化核酸纯化核酸样本样本43.用于用于RNA测定的已纯化核酸样本测定的已纯化核酸样本-804.用乙醇沉淀的核酸样本用乙醇沉淀的核酸样本-205.GITC处理的处理的RNA标本在室温可保存标本在室温可保存7天天（五）标本的处理（核酸提取）（五）标本的处理（核酸提取）抑制物抑制物可能来源于：可能来源于：标本本身（如血红素及其前体或降标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。解产物）。核酸提取过程中残留的有机溶剂核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。（如酚、氯仿等）。痰须液化处理。痰须液化处理。操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）操作时（加裂解液后
13、充分混匀，沸水浴）操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）注意：注意：注意：注意：离心管不能插得过低，以防进水；离心管不能插得过低，以防进水；离心管不能插得过低，以防进水；离心管不能插得过低，以防进水；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时间须准确，水浴时间须准确，水浴时间须准确，水浴时间须准确，101101minmin； 水浴时不能走开；水浴时不能走开；水浴时不能走开；水浴时不能走开；左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器左右手分开
14、，左手只接触样本，右手只接触加样器左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。及操作仪器。及操作仪器。及操作仪器。（六）靶核酸的逆转录（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增和扩增有有多多种种因因素素可可引引起起核核酸酸扩扩增增检检测测假假阴阴性性结结果果，如如扩扩增增靶靶核核酸酸中中抑抑制制剂剂存存在在、Taq酶酶失失活活、退退火火温温度度不不对对、Mg+浓浓度度不不佳佳、患患者者标标本本或或试试剂剂受受污污染等。染等。扩增仪孔中热传导的扩增仪孔中热传导的均一性均一性极为极为重要。重要。RT-PCR操作注意：操作注意：标本必须新鲜；标本必须新鲜；标本必须新鲜；标本必须新鲜；做做做做RN
15、ARNA标本的枪头离心管必须无菌；标本的枪头离心管必须无菌；标本的枪头离心管必须无菌；标本的枪头离心管必须无菌；冰上操作；冰上操作；冰上操作；冰上操作；处理完后须立即上机，不能放置；处理完后须立即上机，不能放置；处理完后须立即上机，不能放置；处理完后须立即上机，不能放置；注意左右手分开。注意左右手分开。注意左右手分开。注意左右手分开。（七）扩增产物的分析（七）扩增产物的分析扩扩增增产产物物的的测测定定有有各各种种方方法法，如如电电泳泳、限限制制性性酶酶切切、斑斑点点印印迹迹、探探针针杂交、测序、分光光度法定量等。杂交、测序、分光光度法定量等。实时荧光定量PCR在荧光定量在荧光定量PCRPCR基
16、础上实时监测基础上实时监测PCRPCR全过程，最后全过程，最后通过曲线进行定量分析。通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量与一般荧光定量PCRPCR使用荧光强度定量不同，实使用荧光强度定量不同，实时荧光时荧光PCRPCR一般使用一般使用CtCtCtCt（每个反应荧光信号达（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，到设定域值所经的循环数）定量，CtCtCtCt与模板初与模板初始拷贝数的对数成线性关系。始拷贝数的对数成线性关系。实时荧光实时荧光PCRPCR的优点：的优点：精密度高，重复性能好。精密度高，重复性能好。TaqMan荧光定量荧光定量PCR原理原理探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，TaqDNA聚合酶的5-3外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；荧光信号强度与扩增产物量成正比；三、三、PCR污染与对策污染与对策PCR污污染染分分环环境境污污染染与与反反应应液液污污染染二二种种。常见常见PCR污染源有三个：污染源有三个：第一、标本间的交叉污染；第一、标本间的交叉污染；第二
